Do fosforylacji substratowej dochodzi, gdy - przy wykorzystaniu
energii organicznego substratu - reszta fosforanowa zostanie w bezpośredni sposób
przeniesiona na ADP (adenozynodifosforan). Często sam substrat jest dawcą reszty
fosforanowej. Fosforylacja substratowa nie wymaga udziału tlenu i zachodzi głównie w początkowych
reakcjach oddychania komórkowego, a przy tym jest to jednocześnie
najstarszy sposób ładowania ATP, lecz niestety nie jest zbyt korzystny energetycznie.
Pozwala np. sprawnie funkcjonować mięśniom szkieletowym podczas dużego
wysiłku fizycznego przy jednocześnie niedostatecznym dopływie tlenu. Ilość związków, które mogą
wejść w reakcję fosforylacji substratowej jest ograniczona.