Sekwencjonowanie DNA – technika odczytywania sekwencji , czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA .

Sekwencjonowanie dokonuje się przy pomocy zautomatyzowanych sekwencjonatorów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów, lub podczas ćwiczeń^[].

• Przykład sekwencji DNA (początek operonu laktozowege E. coli z GenBank ):

GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG

gdzie: A – adenina ; C – cytozyna ; G – guanina ; T – tymina

Metody historyczne

Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w 1981 ^[1]- r metoda Sangera , oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro . Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem . Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie , co powoduję ich segregację pod względem wielkości.

Metody współczesne

Obecnie metoda odczytu została zautomatyzowana dzięki wykorzystaniu znakowanych fluorescencyjnie trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej kapilary lub linii na żelu ^[].

Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli Walter Gilbert i Allan Maxam ( metoda Maxama-Gilberta )^[2]. Gilbert wraz z Frederickiem Sangerem otrzymali za to osiągnięcie nagrodę Nobla w dziedzinie chemii . Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.

Nowoczesne masowo równoległe aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów par zasad na godzinę^[]. Tranzystory polowe DNA umożliwiają użycie natywnego DNA w hybrydyzacji do mikromacierzy i odczyt w czasie rzeczywistym.

Nagroda Archon Genomics X PRIZE w wysokości 10 mln dolarów czeka na ośrodek, który będzie w stanie zsekwencjonować 100 genomów ludzkich w ciągu 10 dni^[3]. Pierwsze sekwencjonowanie genomu człowieka zajęło wiele lat (zob. Projekt poznania ludzkiego genomu ).

Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA są na tyle tanie, iż setki tysięcy osób zapłaciły za zbadanie swojego DNA i wzięły udział w Projekcie Genograficznym . Ta względna taniość umożliwiła również rozwój m.in. genetyki genealogicznej oraz wielu rodzajów badań testujących obecność mutacji .

Metody rozwojowe

• PCR
• Metodą bąbelkową + pyrosekwencjonowanie
  • 454 sequencing pozwala 300 MBp na dzień w jednej maszynie [1] . Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania aDNA.

• bezpośredniego odczytu^[]:
  • nanosekwencjonowanie. Przesuwająca się cząsteczka DNA poprzez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio. Szybkość takiego odczytu może dochodzić od 300 Bp/s dla pojedynczego nanometrowego czujnika^[4].
  • mikroskopowe

Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA

• 1953 – opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka
• 1972 – opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich replikację.
• 1977 – Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt. Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie .
• 1980 – Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali nagrodę Nobla
• 1982 – utworzono Genbank – publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA
  • Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA
• 1982 – Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi .
• 1984 – badacze z MRC odczytali kompletną sekwencję wirusa Epstein-Barr , 170 kb.
• 1997 – zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii Escherichia coli .
• 2001 , 15 lutego – Konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w Nature .
• 2001 , 16 lutego – firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Science .

Przypisy