Laseczki wąglika zabarwione metodą Grama ( Gram + )

Escherichia coli zabarwiona metodą Grama ( Gram - )

Metoda Grama – metoda barwienia bakterii . Pozwala doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie duże grupy ( Gram-dodatnie i Gram-ujemne ) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie, także pewne różnice w fizjologii i podatności na leki .

Została opracowana w 1884 przez Duńczyka , Hansa Christiana Grama ( 1853 – 1938 ).

Sposób barwienia

• na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść bakterie i po ewentualnym dodaniu płynu fizjologicznego wykonać rozmaz
• szkiełko z rozmazem pozostawić do całkowitego wyschnięcia, po czym preparat utrwalić przez trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika
• utrwalony preparat zalewać nad rynienką roztworem fioletu krystalicznego
• odczekać 60 sekund
• tryskawką delikatnie zmyć barwnik
• zalać preparat jodyną lub płynem Lugola
• odczekać 30 sekund
• ostrożnie odbarwić całość w etanolu przez ok. 10-20 sekund
• spłukać preparat wodą destylowaną
• dobarwić innym barwnikiem, np. safraniną czy fuksyną zasadową przez ok. 30 sekund
• dobrze spłukać preparat wodą destylowaną i po wyschnięciu oglądać pod mikroskopem

Mechanizm barwienia

1. Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym.
2. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem , w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie granatowe.
3. Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1–2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik.
4. Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są granatowe, zaś Gram-ujemne – bezbarwne.
5. Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna ) dobarwia, niezbyt mocno, komórki Gram-ujemne, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.

Efekt barwienia Grama

W efekcie wyżej przedstawionych działań i opisanego mechanizmu komórki efekty mogą być trojakie:

• bakterie barwią się na kolor ciemno-fioletowy, prawie czarny, określamy jako Gram-dodatnie lub (Gram +)
• bakterie barwią się w kolorze czerwonym, określamy jako Gram-ujemne lub (Gram -)
• bakterie nie barwią się w ogóle metodą Grama

Zobacz też

• inne metody barwienia

Bibliografia

1. Władysław J.H. Kunicki- Goldfinger : Życie bakterii. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 1998. .